發(fā)布日期：2017-04-17

來自韓國基礎(chǔ)科學(xué)研究所IBS的研究人員發(fā)表了題為“Genome-wide target specificities of CRISPR RNA-guided programmable deaminases”的文章，證實了最近研發(fā)的基因編輯方法的準(zhǔn)確性。這一研究成果公布在4月10日的Nature Biotechnology雜志上。

文章的通訊作者是基因編輯領(lǐng)域的大牛KIM Jin-Soo，其研究組曾在Nature等頂級雜志發(fā)表多篇文章，提出了CRISPR技術(shù)領(lǐng)域的不少創(chuàng)新想法，比如他們曾設(shè)計出了目前最小的CRISPR-Cas9，并通過腺伴隨病毒（AAV）將其遞送到了肌細(xì)胞和小鼠的眼睛里，用以編輯導(dǎo)致失明的基因。

對于最新這項研究，Kim表示，“這是第一次在整個基因組水平上驗證了這種堿基編輯的準(zhǔn)確性”。

基因編輯工具的快速發(fā)展令整個生物學(xué)研究領(lǐng)域瘋狂，目前第三代DNA剪刀的主角是CRISPR，這是一種比其前身更快更便宜的工具。CRISPR-Cas9和CRISPR-Cpf1通過切除小的DNA序列，訥訥感沉默或降低錯誤基因的表達(dá)。然而，去年一種新的堿基編輯方法：不會引起隨機(jī)的DNA缺失和插入，而是替換一個DNA基因，吸引了生物學(xué)家的注意。

這種基因校正方法很關(guān)鍵，因為一些疾病就是因為DNA的四種基本組分之一（腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、鳥嘌呤（G）和胸腺嘧啶（T））出錯引起的。DNA中的單核苷酸錯誤被稱為點突變，由點突變引起的疾病包括：囊性纖維化，鐮狀細(xì)胞性貧血和色盲。

與現(xiàn)有的第三代DNA剪刀不同，單堿基編輯方法是由與CRISPR-Cas9（nCas9，切口酶）變體與另外一種稱為胞嘧啶脫氨酶（cytosine deaminase）構(gòu)成，用T代替C，通過導(dǎo)向RNA直接指向正確DNA位置。不過到目前為止，還不知道這種堿基編輯器是僅在錯誤基因區(qū)域中發(fā)揮作用，還是能在其它區(qū)域進(jìn)行替換（脫靶）。

上個月，IBS的研究人員分別改變了肌營養(yǎng)不良蛋白基因（Dmd），以及酪氨酸酶基因（Tyr）中的單個核苷酸，用以檢驗CRISPR-nCas9胞苷脫氨酶的融合。研究獲得了兩方面的成功：攜帶Dmd基因單個核苷酸突變的小鼠胚胎，導(dǎo)致小鼠肌肉中無法產(chǎn)生dystrophin蛋白；另外一種是攜帶Tyr突變的小鼠，顯示的病癥是白化病性狀。Dystrophin蛋白與肌肉肌營養(yǎng)不良癥疾病相關(guān)，酪氨酸酶控制黑素的生成。

而在最新這項研究中，他們又在基因組范圍能驗證了這一方法的準(zhǔn)確性，并在肌營養(yǎng)不良蛋白和酪氨酸酶基因中修改了單個核苷酸。

為了確定整個基因組的基因編輯正確性，研究人員修改了一種錯誤檢測技術(shù)：Digenome-seq，這一技術(shù)可在全基因組范圍內(nèi)檢測人類細(xì)胞中的CRISPR/Cas9脫靶效應(yīng)（新方法終結(jié)CRISPR-CAS9爭論）。同時也改進(jìn)了計算機(jī)程序（Digenome 2.0），更全面地識別脫靶，比較了不同的導(dǎo)向RNA，從而找到了減少故障并增加特異性的RNA。

利用這種技術(shù)，研究人員驗證了堿基編輯器技術(shù)的正確性，并且發(fā)現(xiàn)它比當(dāng)前第三代CRISPR-Cas9更準(zhǔn)確。堿基編輯技術(shù)能誘導(dǎo)人類基因組中1-67個位點發(fā)生C-to-T轉(zhuǎn)換，而CRISPR-Cas9在30-241個位點能進(jìn)行切割，這意味著堿基編輯器正在減少脫靶變化。 “因此，預(yù)計這些堿基編輯器將會成為廣泛使用的受歡迎CRISPR技術(shù)，”Kim說。

來源：生物通