發(fā)布日期：2018-06-21

  　5月 31日，國際學術(shù)期刊 Nucleic Acids Research 在線發(fā)表了中國科學院分子植物科學卓越創(chuàng)新中心 / 植物生理生態(tài)研究所李軒研究組合作完成的題為 Implementation of the CRISPR-Cas13a system in fission yeast and its repurposing for precise RNA editing 的研究論文。該工作報道了一個利用新發(fā)現(xiàn) CRISPR 家族中的 Cas13 蛋白（VI 型）及其指導 RNA（guide RNA）靶向結(jié)合特異序列單鏈 RNA 的能力，通過設(shè)計改造并與人源的 RNA 脫氨酶催化結(jié)構(gòu)域（hADAR2d）結(jié)合，實現(xiàn)了精確定點 RNA（A→I）編輯的人工機器。與近年來利用 CRISPR 家族蛋白（例如 Cas9）對 DNA 編輯來修改基因 / 調(diào)控基因表達不同，Cas13 體系不涉及編碼基因 DNA 的改變，而是通過對基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA）進行編輯，為改變基因功能和調(diào)控表達提供了新的方法和思路。

　  近年來利用 CRISPR 技術(shù)對生物物種基因 DNA 的編輯（包括切割和堿基替換），獲得了巨大的成功，同時也面臨技術(shù)上的限制。與 DNA 編輯技術(shù)互補，一個針對 RNA 的精確定點編輯技術(shù)，有獨特的技術(shù)優(yōu)勢和應(yīng)用。與 DNA 編輯技術(shù)相比，RNA 的定點編輯不改變編碼基因本身（DNA 堿基改變后不能逆轉(zhuǎn)），在時間上、空間上和效率上更加可控。同時，RNA 編輯可以同時修改多個基因、同時靶向多拷貝基因的所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（尤其是對多倍體的物種），所以更加高效。在對疾病的基因治療領(lǐng)域，利用 RNA 定點編輯修復疾病組織的突變基因，有著重要的應(yīng)用價值。

　　為了實現(xiàn)精確定點 RNA 編輯的人工機器，李軒研究組與研究員楊晟、中科院上海巴斯德研究所研究員郝沛及美國密歇根大學教授王紅兵合作，對新發(fā)現(xiàn) CRISPR 家族中具有結(jié)合特異序列單鏈 RNA 能力的 Cas13a，首先在模式生物裂殖酵母（S pombe）中實現(xiàn)了其靶向內(nèi)源 RNA 和降解靶標 RNA 的功能。進一步，設(shè)計  利用 Cas13a 的改造產(chǎn)物 dCas13a（喪失 RNA 切割活性的突變），將 dCas13a 與人源的 RNA 腺嘌呤脫氨酶催化結(jié)構(gòu)域（hADAR2d）融合，引入到裂殖酵母中；再通過設(shè)計 RNA 編輯機器的靶向“零件”指導 RNA，實現(xiàn)了對內(nèi)源 RNA 的精確定點編輯。為了對 RNA 定點編輯機器的設(shè)計和參數(shù)（編輯堿基位置、距離、指導 RNA 結(jié)構(gòu)和長度等）進行優(yōu)化，研究人員構(gòu)建了一系列不同的設(shè)計，并利用一個雙熒光報告（reporter）系統(tǒng)來測試不同設(shè)置的編輯效率，從而獲得了精準 RNA 編輯機器的最優(yōu)參數(shù)。優(yōu)化后的編輯機器對內(nèi)源靶標 RNA 的編輯效率達到了 59%。最后，該研究實現(xiàn)的精準 RNA 編輯機器的功能，進一步體現(xiàn)在對裂殖酵母反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子 Tf1 突變株的修復和操作的實驗中。Tf1 與動物細胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒類似，其跳躍和擴增需要經(jīng)過中間體 RNA 的逆轉(zhuǎn)錄步驟。研究人員利用精準 RNA 編輯，恢復了 Tf1 突變株的轉(zhuǎn)座能力，這個應(yīng)用對逆轉(zhuǎn)錄病毒干預和操作提供了一個有潛力的工具。

　　該研究主要由荊新云和解冰冉等人完成。相關(guān)工作得到了中國農(nóng)業(yè)部項目、國家科技重大專項和自然科學基金項目的支持。

來源：上海生命科學研究院